超低溫冰箱在高山冰緣植物抗凍蛋白分離的應(yīng)用

   抗凍蛋白zui早在南極魚(yú)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)，是一類(lèi)能夠抑制冰晶生長(zhǎng)的特殊蛋白.由于抗凍蛋白分布的不普遍性，很難從特定幾種植物中找到，并且傳統(tǒng)的質(zhì)外體提取技術(shù)難掌握。

   先將液氮保存的高山冰緣植物葉片高山紅景天、高山早熟禾、高山離子芥、株芽蓼利用液氮進(jìn)行研磨，研磨得到的粉末用PH8.0磷酸緩沖液混勻，并12000g離心10分鐘，取上清，此為可溶性蛋白粗提液，將45毫升粗提液放入50毫升小燒杯5在層析冷柜低溫4℃保存待用。用高壓氮?dú)馔ㄟ^(guò)減壓閥門(mén)2以0.1兆帕壓力順導(dǎo)管3流經(jīng)液氮進(jìn)行探頭預(yù)冷，探頭浸入含蛋白粗提液的50毫升小燒杯5進(jìn)行凍冰吸附，內(nèi)放轉(zhuǎn)子進(jìn)行磁力攪拌保持溶液均勻。

  當(dāng)燒杯內(nèi)液面下降5毫升后取出凍冰探頭7，室溫融化冰晶，補(bǔ)加磷酸緩沖液至45毫升，重復(fù)用探頭凍冰吸附一次。第二次凍冰的冰晶室溫融化，利用截流量5000道爾頓的透析袋在無(wú)離子水中脫鹽12小時(shí)，每隔2小時(shí)換水，脫鹽后透析袋埋入PEG8000的粉末中濃縮。濃縮后的蛋白溶液用用考馬斯亮藍(lán)G250比色法測(cè)定濃度，用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將定量后的蛋白用20％蔗糖溶液稀釋成1mg/L和5mg/L濃度，滴加到一載玻片，覆蓋一蓋玻片壓成均勻液膜。將制片放入上海田楓-70℃超低溫冰箱內(nèi)30分鐘凍冰后，通過(guò)塑料泡沫板13操作入口迅速將制片11放到顯微鏡9載物臺(tái)，通過(guò)照相目鏡子10操作觀察口觀察中向蓋玻片上加一滴二甲苯，100倍油鏡觀察，調(diào)整視野，重結(jié)晶15分鐘后放上照相機(jī)照相記錄，發(fā)現(xiàn)高山離子芥和株芽蓼具有抑制重結(jié)晶的活性.

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